CONTROL DE LA VELOCIDAD DE ENFRIAMIENTO

Preguntas clave:

· ¿Cómo se puede controlar la velocidad de enfriamiento de forma reproducible?

· ¿Cuándo es una opción la congelación pasiva?

· ¿Qué es la vitrificación directa?

La velocidad de enfriamiento óptima para una muestra biológica en particular puede estar disponible en la literatura, pero con toda probabilidad, se requerirá alguna modificación del protocolo para adaptarlo a las condiciones y necesidades locales.

Cuando no se dispone de una tasa recomendada, entonces se requerirá un nivel significativo de experimentación, comenzando con tasas notificadas para materiales que son, de alguna manera, similares a las muestras de interés.

Una vez determinada, la tasa requerida se puede lograr de muchas maneras.

Congelación pasiva

La congelación pasiva es una técnica simple mediante la cual el contenedor de la muestra se mantiene en un dispositivo simple pre enfriado a una temperatura que permitirá una transferencia exitosa y directa al entorno de almacenamiento, por ejemplo enfriado a -80 ° C, antes de sumergirse directamente en LN.

La velocidad de enfriamiento alcanzada depende de la temperatura del dispositivo y del medio en contacto con la muestra del recipiente. En una unidad disponible en el mercado, una pieza de espuma se coloca en el interior de la unidad con isopropanol pre enfriado (C3H80) manteniendo frío el fregadero cuando frascos de muestra están incrustados en él. La unidad cerrada se mantiene en -80°C para proporcionar una tasa de congelación nominal de -1°C por minuto.

Este protocolo relativamente poco sofisticado puede funcionar bien para muchos tipos de células o volúmenes más pequeños donde no se requiere refrigeración variable. Es barato en lo que se refiere a equipamiento y dentro de ciertos límites, reproducible, aunque no es lineal. Cuando se requieren velocidades de enfriamiento distintas de 1°C por minuto-1, los laboratorios pueden ser capaces de crear su propio sistema de congeladores que utilizan materiales relativamente simples y baratos.

Como con cualquier equipo diseñado para lograr el éxito en la criopreservación, el volumen de muestra, el tipo de muestra, el medio de congelación, el posicionamiento, el embalaje y el cierre uniforme del envase pueden repercutir en el rendimiento de la temperatura e, inevitablemente, afectar a la eventual supervivencia celular.

Congelación controlada de la tasa (Controlled Rate Freezing)

Muchos tipos de muestras requerirán un control preciso y cuidadosos programas de refrigeración y calentamiento, algunos de los cuales incorporan diferentes velocidades de enfriamiento para ofrecer la máxima supervivencia. Los períodos de mantenimiento a las temperaturas prescritas para el equilibrio también pueden ser parte de estos protocolos más complejos.

En tales casos, los congeladores de tasa controlada (Controlled Rate Freezers) se vuelven necesarios, con opción de múltiples programaciones para asegurar que cada perfil de temperatura de criopreservación sea preciso, reproducible y almacenable para su auditoria y referencia futura.

Un ejemplo de un patrón ampliamente utilizado de enfriamiento controlado comenzaría con el enfriamiento a 4°C, ya que la muestra se somete a un proceso de preparación con procedimientos como la adición de crioprotectores con los viales incrustados en hielo. El próximo paso en el proceso consistiría en reducir la temperatura de manera relativamente rápida (p. ej. 5°C min-1) a una temperatura intermedia que podría mantenerse durante varios minutos para permitir la nucleación del hielo (p. ej. -8°C). A continuación, las muestras se enfriarían lentamente (1°C min-1) a una temperatura base de -40°C. Después de un segundo período de espera de varios minutos, los viales serían retirados rápidamente de la cámara de congelación e inmersos directamente en LN.

El punto en el que realmente comienza la congelación varía entre muestras si no se emplea la nucleación inducida. Con un baño (una inmersión), la nucleación del hielo puede iniciarse de una manera consistente y repetible.

Vitrificación directa

El vitrificado directo para la criopreservación es una técnica mediante la cual muestras de pequeño volumen, típicamente medidas en microlitros, son tratadas con protectores de alta osmolaridad para deshidratar las soluciones citoplasmáticas hasta el punto en que, cuando se enfrían rápidamente, ellos vitrificarán directamente para formar un vidrio en lugar de hacer la transición de fase en hielo cristalino. Este pretratamiento se lleva a cabo comúnmente en hielo y reemplaza la deshidratación lograda en el enfriamiento de velocidad controlada (descrito más arriba). Es una técnica ampliamente utilizada, con éxito, tanto para gametos y embriones de mamíferos.

La duración del tratamiento de deshidratación de pre enfriamiento es, necesariamente limitado debido a la toxicidad y al estrés osmótico, por lo que para conseguir un catión vitrificado se requieren velocidades de enfriamiento ultrarrápidas, a menudo por encima de 5000°C min-1. Esto puede lograrse si la muestra tiene un volumen muy pequeño y si la inmersión en LN es suficientemente rápida, con agitación para asegurar que ninguna burbuja del gas nitrógeno se forma en la superficie de la muestra y se adhiere a ella, produciendo un efecto aislante de Leidenfrost.

Mientras que los portadores de especímenes especializados, cerrados, están disponibles, las velocidades de enfriamiento muy rápidas requeridas a menudo se logran mediante la inmersión directa de las muestras desnudas en LN antes de la transferencia, bajo LN, en un recipiente secundario como un criovial convencional.

Dichos protocolos podrán plantear problemas de contaminación cuando el LN utilizado en la refrigeración y en los recipientes de almacenamiento no sea completamente estéril.