Procedimientos de congelación y descongelación

Preguntas clave:

· ¿Por qué debería controlarse la nucleación del hielo?

· ¿Cuál es el papel de un crioprotector?

· ¿Por qué varían los protocolos de criopreservación?

· ¿Es importante la velocidad de descongelación?

Los efectos físicos y biológicos de un proceso de enfriamiento pueden ser tolerados, sin daño, por un rango limitado de especímenes, pero la gran mayoría sufriría una lesión letal sino se emplea algún tipo de protocolo de protección. La mejor manera de protegerse de estos daños es mediante el uso combinado de nucleación controlada del hielo, aditivos como protectores químicos (crioprotectores) y la manipulación adecuada de las tasas de enfriamiento y calentamiento.

Los químicos crioprotectores se agregan a las células inmediatamente antes de comenzar el protocolo de preservación. Penetran en las células, en mayor o menor medida, inhiben la formación de hielo intracelular y protegen contra los efectos dañinos de un citoplasma cada vez más concentrado.

Los crioprotectores pueden ser tóxicos, en diversos grados, para las células y el tiempo de su uso, la concentración y la temperatura de aplicación deben equilibrarse con los beneficios de supervivencia.

Los crioprotectores comunes incluyen dimetilsulfóxido, etanodiol, glicerol y propanediol.

Inmediatamente se nuclea el hielo en la matriz extracelular, las células experimentan un grado de choque osmótico potencialmente dañino a medida que los solutos se concentran en el líquido residual que rodea las células. Esta concentración externa mejorada de solutos causa un movimiento significativo de agua fuera de las células que conduce a lesiones por deshidratación (efectos de la solución). Sin embargo, el riesgo de lesiones se puede minimizar asegurando que el hielo se nuclea a la temperatura más temprana posible, produciendo el nivel más bajo posible de estrés osmótico inicial.

Esta nucleación inducida es necesaria ya que las soluciones se vuelven fácilmente súper-enfriadas, cayendo por debajo de su punto de congelación nominal pero sin la formación de hielo, p. el agua sufrirá el cambio de fase en hielo si se nuclea solo un poco por debajo de 0 ° C, pero puede permanecer sin congelar (súper enfriada) hasta -40 ° C por debajo de cero.

Si se produce un súper enfriamiento significativo antes de la nucleación, se puede esperar un nivel alto e instantáneo de estrés osmótico potencialmente letal.

Hay varias maneras mecánicas de inducir la nucleación, incluida la agitación rápida de viales enfriados, tocar un implemento refrigerado por la parte externa del contenedor de congelación (por ejemplo, pinzas con puntas enfriadas en LN) o acelerar brevemente la velocidad de enfriamiento (un enfriamiento). Algunos congeladores programables tienen un accesorio para efectuar la nucleación. También están disponibles comercialmente diversos aditivos no tóxicos que inducirán la nucleación a la temperatura más alta posible en soluciones enfriadas adecuadamente.

Una vez que el hielo se nuclea, la temperatura de la muestra, inevitablemente, comenzará a aumentar debido al calor latente liberado durante la formación de hielo (exotermia). Si no se controla, este aumento de la temperatura puede ser perjudicial, ya que la proporción de hielo en el sistema fluctúa; de modo que el protocolo de enfriamiento debe adaptarse para minimizar este aumento, típicamente mediante un aumento en la velocidad de enfriamiento al menos hasta que se elimine la exotermia del calor latente.

Después de que se nuclea el entorno extracelular, el siguiente desafío en el protocolo es controlar la velocidad de enfriamiento para garantizar que se produzca la cantidad necesaria de deshidratación celular protectora. Habrá velocidades de enfriamiento lentas que producen demasiado estrés osmótico debido a la duración de la exposición al hielo extracelular y las tasas de enfriamiento rápido que limitan la deshidratación y aumentan la probabilidad de formación letal de hielo intracelular a niveles inaceptables. En el medio habrá una tasa de enfriamiento "óptima" que mantenga ambas tensiones en niveles aceptables.

Es posible que sea necesario variar la velocidad de enfriamiento durante el protocolo, que deberá determinarse para cada tipo de célula diferente. El objetivo es eliminar suficiente agua de la célula para permitir que el agua en el citoplasma concentrado se vitrifique a medida que avanza el enfriamiento, es decir, se forma un "vidrio" menos perjudicial en lugar de hielo altamente dañino, cristalino. Típicamente, el enfriamiento para lograr la deshidratación continúa hasta una temperatura base entre -35 y -45 ° C antes de que la muestra se sumerja directamente en LN.

En la mayoría de las situaciones, el calentamiento rápido es esencial para una buena supervivencia celular, con tasas subóptimas que aumentan la probabilidad de formación de hielo intracelular a medida que la muestra se descongela, con la pérdida inevitable de la viabilidad. Los recipientes de muestra más pequeños, como los crioviales, pueden sumergirse en agua a 37 ° C y monitorearse visualmente hasta que los últimos cristales de hielo se hayan derretido. Pequeñas variaciones del perfil de calentamiento requerido pueden causar una pérdida significativa de viabilidad, por lo que las muestras deben transferirse directamente desde LN al baño de calentamiento. El control de volumen y calentamiento del baño debe evitar cualquier reducción significativa de la temperatura debido a la introducción de la muestra. Una vez descongelada, es posible que deba enjuagarse una muestra para eliminar los crioprotectores y también puede necesitar tiempo para reparar las lesiones. Una temperatura de incubación reducida, evitar temblores y el almacenamiento en la oscuridad pueden ser útiles en esta etapa.