Eventos físicos durante la crioconservación

Preguntas clave:

• ¿Qué sucede con las muestras cuando se les congela el agua?
  
• ¿Por qué se deshidratan las células durante la congelación?
  
• ¿Por qué algunas células son dañadas por el congelamiento?
  
• ¿Importa la velocidad de enfriamiento?
  

Para entender los diferentes elementos que contribuyen al éxito de un proyecto de criopreservación, es útil considerar el protocolo progresivo de secuencia de cambios físicos y químicos que ocurren en el material biológico (y alrededor) durante el procesamiento.

Desde un punto de vista criobiológico, una muestra puede verse como contiene dos partes discretas, y la secuencia de eventos que ocurren dentro de estos durante la criopreservación es diferente. En primer lugar, está el ambiente intracelular que consiste en el ambiente interno de las células encerradas en sus membranas celulares limitantes.

En segundo lugar, está el entorno extracelular que incluye eñ líquido en el que están suspendidas las células o, en el caso de los tejidos, la matriz líquida que existe entre las células individuales.

Para muchos tipos de células, el enfriamiento y conservación en nitrógeno líquido (LN) puede ser relativamente sencillo, sin embargo, como consecuencia del proceso de enfriamiento y antes de que ocurra cualquier congelación, las membranas de ciertos tipos de células pueden dañarse (por ejemplo, algunos tipos de espermatozoides de mamíferos). Esto se conoce como lesiones después de la congelación y puede contribuir a aumentar las posibilidades de que se produzcan efectos letales. Es un fenómeno bien conocido y las formas de minimizarlo se documentan a menudo para cada célula involucrada. Es importante ser claro en cuanto a si tal lesión por frío se aplica a los tipos de células que se propone utilizar, ya que este fenómeno puede limitar el rendimiento de una determinada criopreservación.

El agua será el componente predominante en casi todas los sistemas biológicos que se preservan y la dificultad crítica en la criopreservación resulta de la transición de fase cuando las soluciones acuosas están enfriadas debajo de su puntos de congelación, es decir, cuando el agua líquida se convierte en hielo cristalino.

El agua que se convierte en hielo ya no puede formar parte de la reacción química normal, y su eliminación del líquido original fase concentra los solutos disueltos en un residuo más pequeño volumen. A medida que el enfriamiento progresa y se forma más hielo, la solución residual se vuelve cada vez más concentrada.

Durante la crioconservación, a velocidades de enfriamiento lentas a moderadas, el hielo se formará primero en la matriz extracelular. Los solutos no pueden ser incorporados a los cristales de hielo para que, al formarse, un concentrado, se desarrollará líquido residual que impondrá tensiones osmóticas en las células, y comenzarán a deshidratarse. Si no se controla estos las tensiones (a menudo referidas como efectos de la solución) pueden causar daños o lesión celular. Un resultado positivo de esta deshidratación es que el el citoplasma se volverá cada vez más concentrado, reduciendo riesgo de formación de hielo dentro de las células. El hielo intracelular es inevitable letal y puede ocurrir ya que la temperatura continúa reduciéndose si esto la deshidratación es insuficiente.

Si la velocidad de enfriamiento durante la criopreservación es demasiado rápida entonces habrá poca o ninguna oportunidad para la deshidratación y la congelación intracelular se vuelve inevitable.

El desafío de la criopreservación exitosa es encontrar un procedimiento de enfriamiento que proporciona deshidratación protectora durante enfriamiento, y evita la congelación dentro de las células. Si el progresivo la deshidratación durante el enfriamiento es efectiva el agua restante en el la célula se formará en un vaso (vitrificación) una vez que la transición al vidrio* la temperatura para la solución ha sido alcanzada. Esto debería causa un daño mínimo y evita la formación letal de hielo. En un protocolo típico de crioconservación esta deshidratación será logrado en algún lugar entre el punto cuando el hielo extracelular se forma primero (nucleación) y, aproximadamente, -40 ° C. Directo la transferencia de -40 ° C a LN asegurará una refrigeración lo suficientemente rápida para lograr con éxito el paso de vitrificación final.

*Transición vítrea: es la conversión directa, o cambio de fase, del agua líquida en un vidrio vítreo en lugar de un vidrio vítreo. que el hielo cristalino. Temperaturas inferiores al punto de transición vítrea (Tg) de las soluciones de agua de polioles, alrededor de - 136°C, parecen ser aceptados como el rango después del cual la actividad biológica se ralentiza enormemente; -196°C (la ebullición de nitrógeno líquido), es la temperatura preferida para almacenar muestras importantes. Mientras los refrigeradores, los congeladores y los congeladores extra-fríos se utilizan para muchos artículos, generalmente el ultrafrío de nitrógeno líquido se requiere para la preservación exitosa de las estructuras biológicas más complejas.